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Beta-escina ha una potente efficacia anti-allergiche e riduce l'infiammazione allergica delle vie aeree sfondo astratto di tipo I ipersensibilità è caratterizzata dalla reazione eccessiva del sistema immunitario contro le sostanze altrimenti innocue. Si manifesta come rinite allergica, congiuntivite allergica, asma allergica o dermatite atopica se mastociti sono attivati nei rispettivi organi. In caso di attivazione dei mastociti sistemica, possono verificarsi anafilassi pericolo di vita. Attualmente, tipo I ipersensibilità sono trattati sia con glucocorticoidi, antistaminici, o stabilizzatori dei mastociti. Sebbene questi farmaci esercitano un forte effetto anti-allergici, il loro uso a lungo termine può essere problematico a causa dei loro effetti collaterali. Risultati Nel corso di una routine nel processo di screening vitro, abbiamo identificato beta-escina come un composto potenzialmente antiallergico. Qui abbiamo testato la beta-escina in due modelli di mouse per confermare questo effetto anti-allergico in vivo. In un modello della prima fase di reazioni allergiche, il murino passiva cutanea modello anafilassi, beta-escina inibito gli effetti di attivazione dei mastociti e degranulazione nella pelle e dose-dipendente impedito lo stravaso di fluidi nel tessuto. Beta-escina anche significativamente inibito la tarda risposta dopo sfida antigene in un modello di allergia ai polmoni con i topi ovoalbumina-sensibilizzati. vie aeree allergica infiammazione stato soppresso, che è stato esemplificato dalla riduzione dei leucociti, eosinofili, IL-5 e IL-13 nel fluido di lavaggio broncoalveolare. esami istopatologici hanno confermato ulteriormente l'infiammazione ridotta del tessuto polmonare. In entrambi i modelli, l'effetto inibitorio di beta-escina era paragonabile al desametasone benchmark. Conclusioni Abbiamo dimostrato in due modelli murini indipendenti di tipo I ipersensibilità che il beta-escina ha potenti proprietà anti-allergiche. Questi risultati e l'eccellente profilo di sicurezza di beta-escina suggeriscono un potenziale terapeutico di questo composto per un nuovo trattamento di malattie allergiche. Contesto La prevalenza delle malattie allergiche, come la rinite allergica, congiuntivite allergica, asma allergica, allergie alimentari e anafilassi è costantemente aumentato nel mondo sviluppato nel corso degli ultimi decenni 1. 2. Queste malattie sono causate da una disfunzione del sistema immunitario in risposta ad agenti ambientali normalmente innocui e sono caratterizzati da una eccessiva attivazione dei mastociti, basofili e cellule T helper del linage Th2. Tipo reazioni di ipersensibilità I coinvolgono molti tipi di cellule infiammatorie, ma mastociti ed eosinofili sono i due principali tipi di cellule effettrici. L'infiammazione allergica è spesso classificato in tre fasi temporali. In una reazione allergica prima fase immediata, immunoglobuline E (IgE) legato a FcRI su mastociti e basofili è reticolato dall'esposizione all'allergene ripetuta. Di conseguenza, queste cellule rilasciano vari pre-formate o in rapida sintesi mediatori chimici. Questi mediatori, come l'istamina, suscitare vasodilatazione, aumento della permeabilità vascolare, edema ed alterazioni funzionali acute negli organi colpiti. La reazione fase iniziale IgE-mediata si verifica in pochi minuti di esposizione agli allergeni. Può essere sia localizzato con sintomi come rinite, congiuntivite, attacchi acuti di asma e orticaria, o sistemica, con conseguente shock anafilattico potenzialmente letale. La seguente risposta in ritardo di fase è iniziata da citochine e chemochine derivati da mastociti, con conseguente reclutamento dei leucociti nei tessuti colpiti 2 5. Nel caso di asma allergica, per esempio, i sintomi clinici osservati sono edema delle vie aeree, maggiore produzione di muco, broncospasmo ricorrente e infiammazione sostenuta del tessuto infiltrandosi leucociti. Infine, può causare una malattia allergica cronica, compresi danno tissutale e rimodellamento 6 9. Allergie di Tipo I sono comunemente trattati da corticosteroidi, antistaminici e gli stabilizzatori dei mastociti. Questi farmaci sono anti-infiammatori, o bloccare l'azione di mediatori allergici, impedendo l'attivazione di cellule o dei processi di degranulazione. Inoltre, broncodilatatori sono usati per il trattamento di asma allergica. Tutte queste terapie aiutare ad alleviare i sintomi di allergia, ma, soprattutto dopo-lungo termine e farmaci ad alte dosi, possono avere abbastanza notevoli effetti collaterali. In particolare, corticosteroidi per via orale possono causare generale immuno-soppressione, fragilità della pelle e la sindrome di Cushing, e anche di nuova generazione antistaminici non sono completamente privo di effetti sedativi 10. 11. Pertanto, vi è ancora una necessità vitale per lo sviluppo di nuovi farmaci antiallergici con tollerabilità soddisfacente per uso a lungo termine. Essi dovrebbero essere efficaci in anticipo così come le reazioni allergiche fase tardiva. Nel nostro laboratorio, una serie di estratti naturali sono stati proiettati in vitro per i loro potenziali effetti anti-infiammatori e anti-allergiche. Tra questi estratti, basse concentrazioni della sostanza di prova beta-escina hanno mostrato un effetto inibitorio nei mastociti IgE antigene-stimolati. Beta-escina è il principale costituente attivo di Aesculus hippocastanum estratti di semi, che si compone di una miscela di saponine triterpeniche 12. Si tratta di una sostanza ben nota con numerosi effetti farmacologicamente interessanti. Beta-escina è stato segnalato per possedere attività anti-infiammatorie, venotoniche ed effetti endotelio-protettivo 13 che sono stati supportati da diversi modelli animali 14 20. Inoltre, diversi studi clinici hanno dimostrato un'ottima tollerabilità di beta-escina. Così, beta-escina è ampiamente utilizzato per il trattamento di insufficienza venosa cronica, ileo post-operatorio, emorroidi, lesioni acute impatto ed è incluso nei prodotti cosmetici 13 21 24. Tuttavia, ad oggi beta-escina non è stato descritto per prevenire o alleviare malattie allergiche. Nel nostro studio abbiamo valutato l'efficacia anti-allergico di beta-escina in due diversi modelli sperimentali murini di allergia: L'anafilassi cutanea passiva (PCA) è un modello ampiamente utilizzato nel modello di vivo per esaminare l'effetto anti-allergico di composti sulla ipersensibilità immediata tipo I reazioni perché imita una reazione mediata dalle cellule mast acuta 25. 26. Ovalbumina (OVA) indotta allergica infiammazione delle vie aeree è un modello che presenta sintomi di asma allergica acuta. E 'causata da una reazione allergica fase tardiva ed è caratterizzata dalla infiammazione delle vie aeree e tessuto polmonare 8. 27. I nostri risultati di questi modelli in vivo dimostrano che il beta-escina è un composto anti-allergiche molto promettente. Risultati Beta-escina riduce significativamente la reazione PCA nei topi Nel modello PCA, mastociti pelle sono passivamente sensibilizzati con antigene-specifica IgE ed attivati mediante somministrazione sistemica dell'antigene corrispondente. Questo porta ad un massiccio rilascio di mediatori allergici e la permeabilizzazione dei vasi sanguigni capillari. Se Evans colorante blu applicata insieme con l'antigene, questo effetto può essere visualizzata stravaso del colorante. L'estensione della zona blu a pelle macchiata è quindi presa come misura per l'intensità della fase iniziale della reazione di ipersensibilità. Per esaminare l'effetto anti-allergico di beta-escina in vivo. in primo luogo abbiamo valutato la sostanza in questo modello PCA. I topi del gruppo di controllo negativo, che ha ricevuto 0,9 soluzione di cloruro di sodio (NaCl) o PBS, ha sviluppato una forte reazione PCA (Figura 1A). Cinque minuti dopo il challenge le macchie di questi topi trattati con veicolo erano già ben visibili e ampliato nel corso del prossimo 10 min. La dimensione media delle macchie blu era 38,8 millimetri 2 1.9 SEM a 15 minuti dopo l'applicazione di antigene, che è stato considerato come 100 risposta. Nel gruppo di controllo positivo, i topi sono stati trattati con 3 mg / kg desametasone, che è tipicamente utilizzato come composto di riferimento in modelli animali allergiche 28. La comparsa di macchie blu in aree cutanee sensibilizzate di topi desametasone è stata ritardata, e le zone erano significativamente più piccola rispetto al gruppo di controllo del veicolo. A 15 min le macchie blu misurati solo 58,3 rispetto al controllo del veicolo (Figura 1A). Sorprendentemente, il trattamento con 3 mg / kg beta-escina anche fortemente soppressa la reazione PCA. L'area media delle macchie blu in 15 minuti si è limitato a 17,4 mm 2 2.0 SEM, che rappresentano solo il 44,7 della superficie media da animali trattati con veicolo (Figura 1A). Ciò indica che il beta-escina inibita la reazione anafilattica più potentemente di desametasone. Considerando le diverse masse molecolari di entrambi i composti, questa efficacia dei beta-escina è particolarmente notevole. La massa molecolare di beta-escina è 1137,3 g / mol, che è 2,8 volte maggiore rispetto alla massa molecolare di desametasone (392,5 g / mol). Pertanto, i nostri risultati con 3 mg / kg di ogni composto suggeriscono che il beta-escina inibisce la reazione PCA più di 3 volte meglio di desametasone quando si confrontano concentrazioni molari. l'efficacia anti-allergica e dose-dipendente di beta-escina nel modello murino PCA. Per PCA induzione, anti-IgE TNP (2,5 g) è stato iniettato per via intradermica nella pelle dorsale a 6 punti indipendenti. Dopo 15 minuti, i topi sono stati sfidati con iniezione endovenosa di 50 g DNP-BSA integrato con 1 Evans colorante blu. Blu zone della pelle colorate sono stati quantificati da fotografie digitali 15 min dopo la sfida. (A) SKH1-topi sono stati pre-trattati per via intraperitoneale con veicolo (10 ml / kg, n 21), desametasone (dex, 3 mg / kg, n 5) o beta-escina (escina, 3 mg / kg, n 12) 6 ore prima dell'applicazione di antigene. (B) diverse concentrazioni di beta-escina (n 4-12) sono stati dati per via intraperitoneale 6 h prima sfida. Per ogni topo è stata calcolata la media di 6 punti. Sulla base di questi valori medio SEM è stata determinata per ciascun gruppo, normalizzato al gruppo di controllo del veicolo (uguale 100) e rappresentato come colonna o punto nel grafico (A) e (B), rispettivamente. differenze significative tra i gruppi di trattamento e il gruppo di veicoli sono indicati con: p 0.001. La proprietà anti-allergiche di beta-escina è dose-dipendente Nel prossimo esperimento, abbiamo esaminato la dose-dipendenza degli effetti anti-allergici di beta-escina nel modello murino PCA. Beta-escina è stata applicata a dosaggi di 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 e 3,0 mg / kg 6 h sfida precedente. Beta-escina notevolmente soppressa la stravaso di Evans blue in tessuto cutaneo in modo dose-dipendente (Figura 1B). La minima dose testata di 1,0 mg / kg ha mostrato alcun effetto sulla reazione PCA ancora. A partire da una concentrazione di 1,5 mg / kg di beta-escina, un effetto inibitorio diventato rilevabile. L'applicazione di 2,0 e 2,5 mg / kg di beta-escina fortemente inibito le reazioni PCA, che ha portato a una riduzione statisticamente significativa con rispettivamente 21,8 e 44,8, quando rispetto al gruppo trattato con veicolo. Il forte effetto è stato osservato con la dose di 3 mg / kg, che ha ridotto la reazione del 55,3. Questi risultati mostrano chiaramente che gli effetti anti-allergici di beta-escina sono dose-dipendente. Effetti di beta-Escin dopo diversi periodi di pre-trattamento nel modello PCA murino Per determinare l'influenza del periodo di pre-trattamento sulla reazione PCA, i topi sono stati iniettati con 3 mg / kg beta-escina 1, 2, 3 o 6 h prima dell'induzione PCA (figura 2). Dopo pretrattamento per 1 h, beta-escina già inibita la reazione del 39,1 rispetto al gruppo del veicolo. L'effetto aumentato a 57,4 inibizione della reazione PCA dopo il pre-trattamento per 2 h. Alle 3 he 6 h punti di tempo, la risposta è stata inibita da, rispettivamente, 48,5 e 55,3,. Periodi più lunghi di pretrattamento (12 o 15 h) non migliorare ulteriormente l'efficacia di beta-escina (dati non mostrati). In conclusione, beta-escina notevolmente inibita la reazione PCA in ogni punto temporale testato in confronto al gruppo di controllo negativo. Il corso di questa risposta al trattamento è coerente con le proprietà farmacocinetiche segnalati di beta-escina in cui è stato raggiunto un livello sierico massimo dopo 2 ore e l'emivita è stato calcolato essere da 6 a 8 ore 13. Effetti della beta-Escin in diversi momenti di pre-trattamento nel modello murino PCA. SKH1-topi sono stati iniettati con beta-escina (3 mg / kg) a differenti tempi prima dell'induzione PCA come descritto in Fig. 1. Per ogni topo è stato calcolato la media di 6 punti. Sulla base di questi valori medio SEM è stata determinata per 4 - 12 (escina) o 21 (veicolo) topi per gruppo di trattamento e normalizzato al gruppo di controllo del veicolo. differenze significative tra i gruppi di trattamento e il gruppo di veicoli sono indicati con: p 0.001. Questa serie di esperimenti nel modello PCA fortemente suggerito che il beta-escina è benefico per il trattamento delle reazioni di ipersensibilità di tipo I immediata e anafilassi. Pertanto, è stato di grande interesse per espandere i nostri studi per un ulteriore modello che riflette la fase tardiva di una reazione allergica, come un modello murino di infiammazione allergica delle vie aeree. Beta-escina riduce l'infiltrazione di leucociti totali ed eosinofili nelle vie aeree in un modello murino di infiammazione allergica delle vie aeree Per determinare se il beta-escina ha effetti su infiammazione allergica delle vie aeree, i topi OVA-sensibilizzati si sono sfidati con aerosol contenente sia OVA antigene o il veicolo controllo PBS. infiltrazione di cellule totale, eosinofilia e la secrezione di citochine Th2 è stato quindi determinato nel bronco alveolare Lavage fluidi (BALFs) di questi topi. Nel gruppo di controllo positivo (topi PBS-trattati), OVA sfida provocato un marcato aumento di cellule infiammatorie nel BALF, specialmente eosinofili, che riflette l'intensità di infiammazione delle vie aeree e la misura di cellula infiltra nei polmoni. Questo era assente nel gruppo di controllo negativo PBS-sfidato (Figure 3A e 3B). In questi esperimenti, desametasone è stato nuovamente utilizzato come farmaco di riferimento. Una dose di 1 mg / desametasone kg una volta al giorno è stato selezionato sulla base della sua massa molecolare (che è 2,8 volte inferiore di beta-escina, come discusso in precedenza), in base ai nostri esperimenti preliminari, e precedenti relazioni 29. 30. Questo composto di riferimento impedito infiltrazione di cellule nelle vie aeree del 56,6 a 40 h (Figura 3A). Beta-escina riduce le cellule totali e reclutamento degli eosinofili in un modello OVA-indotta di infiammazione allergica delle vie aeree. topi BALB / c sono stati sensibilizzati con OVA nei giorni 0, 14 e 21. Le sfide aerosol con OVA o PBS sono stati eseguiti due volte al giorno nei giorni 28 e 29. 40 ore dopo l'ultima sfida di aerosol, i topi sono stati sacrificati per le analisi di l'infiammazione delle vie aeree dei polmoni. I gruppi sono stati trattati come segue: gruppo di controllo PBS-sfidato, trattato con gruppo PBS PBS OVA-sfidato, trattati con PBS gruppo dex OVA-sfidato, trattato con desametasone (1 mg / kg, una volta al giorno) e il gruppo escina OVA-sfidato, trattato con beta-escina (3 mg / kg, due volte al giorno). Gruppi sono stati confrontati rispetto ai conteggi totali delle cellule (A) e il numero di eosinofili (b) nel BALFs. Ogni barra rappresenta la media di 13 - 21 topi dal 4 esperimenti indipendenti ma identiche SEM di una serie di esperimenti simili. Differenze significative del dex e gruppi escina al gruppo PBS sono indicati con: p 0.001. Sulla base dei risultati del modello PCA, una dose di 3 mg / kg beta-escina è stato somministrato due volte al giorno per mantenere il livello sierico di beta-escina durante il periodo di sfida. Il numero di cellule BAL totale era significativamente diminuita nel gruppo beta-escina trattati rispetto al gruppo trattato con PBS, determinando una riduzione del 49,5 a 40 ore dopo l'ultima sfida (Figura 3A). Inoltre, sia il beta-escina e desametasone trattamento ha ridotto significativamente il numero di eosinofili nel BALF. Beta-escina trattamento potentemente inibito l'infiltrazione di eosinofili nelle vie aeree di circa 61,7 a 40 ore (Figura 3B). I nostri risultati indicano che il beta-escina riduce l'infiammazione delle vie aeree e impedisce l'infiltrazione di eosinofili nelle vie aeree in questo modello allergia. Beta-escina riduce il rilascio di citochine asma-associata a citochine Th2 BAL-associati sono tipicamente rilasciato in reazioni allergiche delle vie respiratorie. Per valutare gli effetti del beta-escina sulla secrezione di citochine, i livelli di IL-5 e IL-13 sono stati determinati in sovranatanti BALF di topi individuali di ciascun gruppo. È stato precedentemente dimostrato in studi cinetici che il rilascio di diversi tipi di citochine nel BAL di picchi topi asmatici in diversi punti temporali. La secrezione massima variava da già il 2 - 4 h per il TNF-alfa a 8 - 12 h, con una lunga durata elevazione, IL-5 e IL-13 31. Sulla base di questo studio abbiamo deciso di effettuare la raccolta dei BALF per la valutazione di IL-5 e IL-13 citochine a 15 h dopo l'ultima sfida. Come mostrato nelle figure 4A e 4B. IL-5 e IL-13 livelli da topi OVA-sfidati e PBS-trattati del gruppo di controllo positivo sono stati notevolmente aumentati rispetto al gruppo di controllo negativo (sfidato e trattati con PBS). L'elevata concentrazione di IL-5 (126,6 11,4 pg / ml) del gruppo di controllo positivo è stato significativamente ridotto dal trattamento beta-escina (90,0 10,8 pg / ml), che era paragonabile alla riduzione ottenuta mediante trattamento desametasone (73,2 12,8 pg / ml). Allo stesso modo, la concentrazione di IL-13 è stata ridotta a 35,8 4,4 pg / ml mediante trattamento beta-escina, che rappresentava un effetto inibitorio di 43.8 rispetto al gruppo di controllo positivo (63,7 9,5 pg / ml). Anche questo effetto era comparabile al composto di riferimento, perché desametasone ridotta la concentrazione di IL-13 a 28.2 7,0 pg / ml (inibizione 55,7). Beta-escina riduce la produzione di citochine in un modello OVA-indotta di infiammazione allergica delle vie aeree. BAL state raccolte 15 ore dopo l'ultima OVA-sfida da topi BALB / c sensibilizzati dei 4 diversi gruppi di trattamento come descritto in Fig. 3. (A) IL-5 e (B) IL-13 livelli nel BAL di topi individuale di ciascun gruppo sono stati determinati mediante ELISA. Ogni barra rappresenta la media di 11 - 16 topi da 3 esperimenti indipendenti ma identiche SEM di una serie di esperimenti simili. Differenze significative del Dex e gruppi escina al gruppo PBS sono indicati con: p 0,01. Questi risultati indicano che il beta-escina successo sopprime la secrezione di citochine Th2 nelle vie aeree di topi OVA-sfidato. Beta-escina riduce l'infiltrazione di cellule infiammatorie nel tessuto polmonare Per esaminare ulteriormente gli effetti del beta-escina sulla patologia polmonare, sono state eseguite le analisi istologiche di sezioni polmonari. tessuto polmonare sono stati raccolti 40 ore dopo l'ultima sfida di aerosol e analizzato da un esperto patologo che è stato accecato per l'identità del campione per garantire una valutazione imparziale. Per quantificare i cambiamenti osservati nel tessuto polmonare, infiammazione e eosinofili rigature sono stati calcolati per ogni campione del mouse da tutti e 4 i gruppi sperimentali, esempi dei quali sono presentati nelle figure 5A - D. Rispetto al gruppo di controllo negativo, l'istologia polmonare da PBS - trattati e topi OVA-sfidato mostrato intensi infiltrati cellulari infiammatori contenenti linfociti, neutrofili, macrofagi e in larga misura eosinofili nel peribronchiolare e perivascolare tessuto connettivo (figure 5A e 5B). trattamento Dexamethasone attenuato l'infiltrazione di cellule infiammatorie nel tessuto polmonare (Figura 5C). Come previsto, anche il beta-escina significativamente ridotto l'infiammazione nel tessuto polmonare. In particolare, l'infiltrazione di eosinofili stato Soppressione rispetto al gruppo PBS (Figura 5D). Figura 5E riassume le marcature per l'infiammazione e l'eosinofilia per i singoli gruppi di trattamento e mette in evidenza la significatività statistica dei miglioramenti da beta-escina o il trattamento desametasone. Beta-escina riduce l'infiammazione e eosinofilia nei polmoni di topi dal modello allergica infiammazione delle vie aeree. microfotografie di rappresentanza in un ingrandimento 20 e 60 volte (nel riquadro) di H (C) topi OVA-sfidati trattati con desametasone (1 mg / kg, una volta al giorno) e (D) OVA-sfidato topi trattati con beta-escina (3 mg / kg, due volte al giorno). Le frecce indicano eosinofili rappresentative del infiltrato. (E) l'analisi semi-quantitativa di cellule infiammatorie peribronchiali e perivascolari e la percentuale di eosinofili in sezioni polmonari sono state effettuate con un sistema di punteggio. Ogni valore rappresenta la media di 13 - 21 topi dal 4 esperimenti indipendenti ma identiche SEM di una serie di esperimenti simili. Differenze significative del Dex e gruppi escina al gruppo PBS sono indicati tra parentesi. Questi effetti inibitori su entrambi i farmaci sono in accordo con i tipi cellulari determinati ei numeri nelle BALFs e confermano che il beta-escina esercita un effetto Ameliorating sulla infiammazione delle vie aeree e anche nel tessuto polmonare. Discussione Questo rapporto presenta il primo studio degli effetti del triterpene naturali saponina beta-escina sulle fasi precoci e tardive di tipo I ipersensibilità in vivo. I nostri risultati dimostrano che il beta-escina fortemente inibisce le reazioni allergiche. Un confronto di riferimento indica che il beta-escina è comparabile o anche superiore a desametasone, un composto di riferimento standard per la valutazione di farmaci anti-allergici e anti-infiammatori. In primo luogo abbiamo individuato l'effetto anti-allergico di beta-escina nel modello murino PCA, dove il beta-escina potentemente soppressa la reazione allergica localizzata mast cellulo-mediata. La valutazione di una serie di periodi di pre-trattamento ha mostrato che l'effetto protettivo di beta-escina durata almeno per 6 h, che è coerente con i dati farmacocinetici pubblicati 13. Inoltre, l'inibizione PCA era strettamente dose-dipendente, che ha confermato la correlazione dose-risposta farmacologicamente rilevanti di beta-escina con la riduzione dei sintomi. Nel modello di infiammazione delle vie aeree allergica acuta abbiamo potuto dimostrare che il beta-escina efficacemente soppressa anche la risposta allergica fase tardiva. Beta-escina esercita effetti benefici sulla vie aeree e infiammazione polmonare, riducendo l'infiltrazione dei leucociti e eosinofilia nei polmoni. Inoltre, esso è diminuito significativamente il rilascio di citochine Th2-specifici nel BALF, come esemplificato da IL-5 e IL-13 misurazioni. Th2-citochine svolgono un ruolo centrale nella patogenesi dell'asma. La citochina IL-5 inizia la differenziazione terminale, la proliferazione, la migrazione e l'attivazione di eosinofili 6. 8. IL-13 può anche regolare il reclutamento di eosinofili delle vie respiratorie attraverso i suoi vari effetti sulle cellule epiteliali e cellule muscolari lisce 32. Coerentemente con la riduzione di queste citochine, il reclutamento di cellule infiammatorie, in particolare di eosinofili, è sensibilmente soppressa nel BALF mediante trattamento beta-escina. L'esame isto-patologico ha mostrato patologia più lieve, ridotta infiltrati cellulari infiammatori e una minore densità di eosinofili nei polmoni dei topi beta-escina-trattati, che ha ulteriormente sostenuto i nostri risultati dall'analisi BALF. Gli eosinofili rilasciano una serie di proteine citotossici, come importante base di proteine, piastrine fattore di attivazione e leucotrieni, che sono responsabili per i danni caratteristici dell'epitelio delle vie aeree nell'asma allergica 33. 34. La riduzione del reclutamento degli eosinofili al tessuto polmonare da beta-escina è quindi fondamentale per ridurre al minimo i danni ai tessuti e / o migliorare il recupero. Infiammazione delle vie aeree costituisce un sintomo chiave nella patogenesi dell'asma. Pertanto, le strategie che inibiscono questa fase iniziale possono essere considerati come un approccio terapeutico promettente 2. 9. 34. Tuttavia, l'asma è caratterizzata come una malattia cronica delle vie aeree, che include ostruzione delle vie aeree e il rimodellamento del tessuto polmonare. Al giorno d'oggi, corticosteroidi per via inalatoria (ICS) sono gli agenti utilizzati principalmente per il trattamento di asma persistente. Considerando che vari e talvolta gravi effetti collaterali sono stati osservati per i corticosteroidi per via orale, ICS ridurre al minimo l'esposizione sistemica e sono in genere ben tollerati. Tuttavia, un certo numero di pazienti con asma sono resistenti a trattamenti con ICS o addirittura di glucocorticoidi orali 35. Ciò indica chiaramente la necessità medica per lo sviluppo di farmaci antiasmatici alternativi con una buona tollerabilità. In precedenza è stato dimostrato che gli estratti di Diplotropis ferruginea, Ganoderma tsugae e ginseng attenuano infiammazione delle vie aeree allergica in modelli murini di asma 29. 36. 37. Ginseng per esempio è stato efficace nel risolvere cambiamenti cronici isto-patologico nei polmoni 29. Tuttavia, nonostante la bassa incidenza di tossicità di ginseng, reazioni avverse, come l'insonnia, ipertensione e diarrea sono stati riportati 29. Per beta-escina, un caso di asma professionale relativi a inalazione di beta-escina è descritta 38. Questo paziente è stato esposto a basse dosi di beta-escina giorno per 30 anni e l'insorgenza dei sintomi avvenne 20 anni dopo l'esposizione iniziale. Mentre questo caso sembra essere un incidenza singolare, si avverte che beta-escina non può essere raccomandato per aerosolterapia inalatoria. La somministrazione orale di beta-escina è una alternativa preferita e sicuro, e non si prevede che il trattamento orale con beta-escina su richiesta clinico causare o esacerbare l'asma. I pazienti affetti da insufficienze venose sono stati trattati con beta-escina per più di 30 anni, senza un rapporto di un aumento delle allergie. Generalmente, beta-escina è considerata avere un livello molto basso di reazioni avverse. Una bassa incidenza di effetti tossici è stato osservato in studi clinici che utilizzano preparati ben caratterizzati 13, che è molto incoraggiante per l'ulteriore sviluppo di beta-escina verso un'alternativa ai farmaci allergia attuali. prospettiva futura Abbiamo dimostrato che il beta-escina è molto potente se applicato dalla somministrazione intraperitoneale. In vista di una applicazione clinica nell'uomo, in futuro, ulteriori percorsi di applicazione, come orale e nasale, saranno esaminati in modelli di allergia. Un'applicazione intranasale può essere adatto per il trattamento localizzato di rinite allergica se una dimensione delle gocce viene generato che preclude l'inalazione di aerosol ai polmoni. Un trattamento sistemico con l'applicazione orale può essere preferito per i pazienti con asma. Al fine di verificare se una applicazione terapeutica di beta-escina è ugualmente efficace per il controllo o inversione di patologie polmonari e il rimodellamento del tessuto polmonare in una fase della malattia, ulteriori studi di trattamento a lungo termine con beta-escina in un modello di asma cronica sono in programma. Per ricevere maggiori comprensione del meccanismo d'azione, sono necessarie ulteriori ricerche per spiegare l'influenza di beta-escina su cascate di segnalazione intracellulare in mastociti, come mitogen - o percorsi proteina chinasi attivata da stress, il flusso di calcio e su tali fattori di trascrizione come NF-B e NF-AT 3. 39. 40, e sulla stabilizzazione delle membrane. Un recente studio ha dimostrato che il beta-escina può compromettere la cascata NF-B-segnalazione in linee cellulari di cancro 41. Considerando il ruolo chiave di NF-B nelle risposte immunitarie e infiammazione, è una possibilità interessante che il beta-escina inibisce reazioni allergiche interferendo con NF-B di segnalazione in modo simile. Chiarire la modalità molecolare di azione dei beta-escina sosterrà l'ulteriore sviluppo di beta-escina come farmaci anti-allergici. Conclusioni I risultati dei nostri studi indicano che il beta-escina offre un trattamento altamente efficace contro precoce così come le risposte allergiche in ritardo di fase in due diversi modelli in vivo per reazioni di ipersensibilità di tipo I. Considerando l'effetto benefico visto nei nostri esperimenti e le eccellenti profili di tollerabilità e sicurezza collaudate in vari modelli animali e studi clinici umani, beta-escina ha un potenziale terapeutico eccitante per il trattamento di malattie infiammatorie allergiche come rinite allergica e asma allergica nell'uomo. Pertanto, gli studi clinici sono previsti per confermare le nostre osservazioni anche in pazienti che soffrono di allergie. Metodi specifiche Animali esenti da organismi patogeni SKH1-topi (ceppo 313, glabro, Charles River, Germania), sono stati utilizzati per il modello PCA, e topi BALB / c (Harlan, Italia) per il modello di asma. Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni standard di laboratorio nella struttura animale della veterinaria dell'Università di Vienna. Tutte le procedure sperimentali sono stati discussi e approvati dal comitato etico istituzionale e eseguite sotto i numeri di licenza animale sperimentale austriaco 68,205 / 0134-C / GT / 2007 e 68,205 / 0206-II / 10b / 2008. Esame e di riferimento composti beta-escina (CAS 6805-41-0 Euro OTC, Germania, e Nobilus Ent, Polonia) e desametasone solubile in acqua (CAS 50-02-2 Sigma-Aldrich, Austria) sono stati sciolti in 0.9 cloruro di sodio (NaCl Mayrhofer, Austria) o in tampone fosfato (PBS PAA, Austria) in concentrazioni indicate per intraperitoneale (ip). modello passivo cutanea anafilassi senza peli SKH1-topi, femmina, 10 settimane, sono stati pre-trattati per via intraperitoneale con beta-escina, desametasone (3 mg / kg) o veicolo (NaCl o PBS, 10 ml / kg) a diversi dosaggi e momenti prima induzione di una reazione PCA come indicato nelle legende testo e figure. Per avviare la reazione PCA, 2,5 g anti-IgE TNP (BioLegend, Austria) diluito in 10 litri di soluzione di NaCl 0.9 è stato intradermica iniettato nella pelle dorsale a 6 punti indipendenti per animale. Quindici minuti dopo la sensibilizzazione, i topi sono stati sfidati da iniezione endovenosa di 0,1 ml 0,9 NaCl contenente 50 g di DNP-BSA (Calbiochem, Austria) e 1 blu di Evans (Sigma-Aldrich, Austria). I topi sono stati sacrificati 15 minuti dopo l'iniezione DNP-BSA e la loro pelle dorsale è stato rimosso per la misura della estensione delle zone della pelle blu macchiate con l'analisi di foto digitali utilizzando il software ImageJ (1,39 d versione NIH http: //rsb. info. nih. gov / IJ /) 25. Gli effetti del beta-escina e desametasone sono state espresse in percentuale dei valori medi dei campioni di controllo del veicolo. L'induzione di infiammazione delle vie aeree e di trattamento: allergica topi femmina BALB / c, 6 - 8 settimane di vita, sono stati divisi in quattro gruppi (n 10 - 13 animali per gruppo). Tutti i topi sono stati immunizzati i giorni 0, 14 e 21 di i. p. iniezioni di 10 g di OVA (Grade V, Sigma-Aldrich, Austria) e 2 mg di Al (OH) 3 (Pierce, USA) sospesi in 0,2 ml di PBS. Nei giorni 28 e 29 dopo la vaccinazione iniziale, gli animali sono stati sfidati per 60 minuti due volte al giorno con 1 OVA sciolto in PBS e aereosol da un nebulizzatore ultrasonico (Kendall Aerodyne 18605, Covidien, Austria). topi di controllo negativo sono stati trattati in parallelo con PBS solo aerosol. 15 o 40 ore dopo l'ultima sfida (giorni 30 e 31), i topi sono stati sacrificati, e l'infiammazione allergica delle vie aeree è stato caratterizzato. I 4 gruppi di trattamento sono stati i seguenti: gruppo di controllo (gruppo di controllo negativo) provocati con PBS e trattati con PBS (10 ml / kg, due volte al giorno, ip), gruppo PBS (gruppo di controllo positivo) provocati con OVA e trattati con PBS come controllo del veicolo (10 ml / kg, due volte al giorno, ip), beta-escina gruppo sfidato con OVA e trattati con beta-escina (3 mg / kg, due volte al giorno, ip), e il gruppo dex sfidato con OVA e trattati con desametasone (1 mg / kg una volta al giorno, ip). I trattamenti iniziati il giorno 27 e terminata il giorno 30 per la valutazione a 15 he il giorno 31 per la valutazione a 40 h dopo l'ultima confronto aerosol. Allergia. Arzneimittelforschung. Vascul Pharmacol. J Ethnopharmacol. N Engl J Med. Mol Pharmacol.
